前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。
本文件由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局提出。
本文件由全國屠宰加工標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAC/TC 516）歸口。
本文件起草單位：中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心、必維信諾（山東）檢測技術(shù)有限公司。
本文件主要起草人：王君瑋、王琳、鄧書、叢睿、趙格、邵緒卿、江翠蕓、高玉斌、宋時(shí)萍。
1 范圍
本文件規(guī)定了豬肉中卡拉膠檢測的制樣和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。
本文件適用于鮮、凍豬肉中卡拉膠的測定。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改）適用于本文件。
GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
3 術(shù)語和定義
本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。
4 原理
試樣經(jīng)鹽酸溶液處理后，其中的卡拉膠被降解生成特征性寡糖。用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測寡糖含量，外標(biāo)法定量。
5 試劑和材料
除另有說明，所有試劑均為分析純。水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。
5.1 試劑
5.1.1 乙腈（CH3CN）：色譜純。
5.1.2 乙酸銨（CH3COCNH4）：色譜純。
5.1.3 濃鹽酸（HCI）：優(yōu)級純。
5.1.4 乙酸鋅［（CHH3COO）2Zn］。
5.1.5 亞鐵氰化鉀［K4Fe（CN）6·3H2O］。
5.2 標(biāo)準(zhǔn)品
卡拉膠（CAS號：9000-07-1），純度≥99%。
5.3 材料
5.3.1 濾膜：水相，0.22μm。
5.3.2 濾膜：有機(jī)相，0.22μm。
5.4 溶液配制
5.4.1 0.005mol/L乙酸銨水溶液：稱取乙酸銨0. 39g，用水溶解并定容至1000mL，過0.22μm水相濾膜。
5.4.2 190g/L乙酸鋅溶液：稱取乙酸鋅19g，用水溶解并定容至100ml。
5.4.3 150g/L亞鐵氰化鉀溶液：稱取亞鐵氰化鉀15g，用水溶解并定容至100mI。
5.4.4 標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000mg/L）：稱取卡拉膠對照品0.010 0g，加入適量水，60℃恒溫水浴溶解。冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶用水定容至刻度，即為1000mg/L儲備液。臨用現(xiàn)配。
6 儀器設(shè)備
6.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子（ESI）源。
6.2 分析天平：感量為0.000 1g和感量為0.01g。
6.3 低溫高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥8000r/min。
6.4 渦旋混合器。
6.5 組織搗碎機(jī)。
6.6 勻漿機(jī)。
6.7 恒溫振蕩水浴鍋。
7 試樣制備與保存
7.1 試樣的制備
取適量新鮮或解凍的空白或供試組織，用組織搗碎機(jī)絞碎并均質(zhì)：
——取均質(zhì)的供試樣品，作為供試試樣；
——取均質(zhì)的空白樣品，作為空白試樣。
7.2 試樣的保存
在-20℃以下保存。
8 試樣處理
稱取5g（精確至0.01g）試樣于50mL離心管中。加入20mL水，于4℃10 000r/min勻漿1min。加入2ml濃鹽酸，渦旋30s，置于80℃恒溫振蕩水浴鍋振蕩2h，取出后冷卻至室溫。依次加入1.5mL190g/L的乙酸鋅溶液、1.5mL150g/L的亞鐵氰化鉀溶液，渦旋1min沉淀蛋白質(zhì)。于4℃8 000r/min離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用乙腈定容，過0.22μm有機(jī)相濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。
9 測定
9.1 液相色譜參考條件
9.1.1 色譜柱：BEH Amide柱（1.7μm，2.1mm× 100mm），或相當(dāng)者。
9.1.2 進(jìn)樣量：1μL。
9.1.3 柱溫：30℃。
9.1.4 流速：0.4mL/min。
9.1.5 流動(dòng)相：A相：0.005mol/L乙酸銨水溶液；B相：乙腈。梯度洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
| 時(shí)間 min | A相 % | B相 % |
| 0.00 | 50 | 50 |
| 2.00 | 50 | 50 |
| 2.01 | 25 | 75 |
| 4.00 | 25 | 75 |
| 4.01 | 50 | 50 |
| 6.00 | 50 | 50 |
9.2 質(zhì)譜參考條件
9.2.1 離子源：電噴霧電離源（ESI）。
9.2.2 參考質(zhì)譜條件如下：
a）檢測方式：多反應(yīng)檢測（MRM）；
b）掃描模式：負(fù)離子掃描；
c）毛細(xì)管電壓：-2.5kV（ESI- ）；
d）干燥氣溫度：325℃；
e）干燥氣流量：8L/min；
f）霧化氣壓力：40psi；
g）鞘氣溫度：350℃；
h）鞘氣流量：10L/mi；
i）多反應(yīng)監(jiān)測條件見表2。
表2 卡拉膠降解產(chǎn)物的質(zhì)譜參數(shù)
| 被測物名稱 | 定量離子對 m/z | 定性離子對 m/z | 碎裂電壓 V | 碰撞能量 eV |
| 特征性寡糖 | 403.0＞97.0 | 403.0＞241.0 | 190 | 34 |
| 403.0＞97.0 | 190 | 46 |
9.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
取5個(gè)50mL離心管，分別準(zhǔn)確加入1 000mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液50μL、100μL、250μL、500μL、1 000μL。然后加入23mL，水，再加入2mL濃鹽酸，加蓋后在渦旋混合器渦旋30s，置于80℃恒溫振蕩水浴鍋振蕩2h。取出后冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用乙腈定容，過0.22μm有機(jī)相濾膜，分別注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，即為1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L工作液。以卡拉膠標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)、定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
9.4 定性測定
通過試樣色譜圖的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間、色譜峰的特征離子與相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰的特征離子相對照定性。試樣與標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間的相對偏差不大于5%。試樣特征離子的相對豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對豐度一致，相對豐度偏差不超過表3的規(guī)定，則可判斷試樣中存在相應(yīng)的被測物。
表3 定性確證時(shí)相對離子豐度的最大允許偏差 單位為百分號
| 相對離子豐度 | ＞50 | 20～50 | 10～20 | ≤10 |
| 允許的最大偏差 | ±20 | ±25 | ±30 | ±50 |
9.5 定量測定
取試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，按外標(biāo)法。以峰面積定量。標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣溶液中的卡拉膠降解產(chǎn)物特征性寡糖響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。在上述色譜質(zhì)譜條件下，卡拉膠降解產(chǎn)物特征性寡糖的特征離子質(zhì)量色譜圖見附錄A。
9.6 空白試驗(yàn)
除不加試樣外，采用完全相同的測定步驟進(jìn)行測定。
10 結(jié)果計(jì)算
結(jié)果按公式（1）計(jì)算。
....................................（1） 式中：
X--試樣中卡拉膠的含量數(shù)值，單位為毫克每千克（mg/kg）；
C--由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的樣品溶液中卡拉膠的濃度數(shù)值，單位為毫克每升（mg/L）；
V--試樣溶液定容體積數(shù)值，單位為毫升（mL）；
M--試樣稱樣量數(shù)值，單位為克（g）。
計(jì)算結(jié)果須扣除空白值。測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。
11 檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度
11.1 靈敏度
本方法的檢測限為3mg/kg，定量限為10mg/kg。
11.2 準(zhǔn)確度
本方法在10mg/kg～100mg/kg添加濃度水平上的回收率為70%～100%。
11.3 精密度
在重復(fù)性條件下獲得的2次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。
附錄A 卡拉膠降解物特征離子質(zhì)量色譜圖 （略）
本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2021年5月7日發(fā)布，2021年11月1日實(shí)施。
