《續(xù)》
5.3 RAPD-PCR
RAPD-PCR（the random amplified polymorphicDNA-PCR）也稱作AP-PCR（arbitrary primer PCR）是一種用任意的隨機引物來檢測DNA序列圖譜的檢測方法。由RAPD-PCR得出的特殊且特定的模型可以用來區(qū)分肉類的物種。RAPD-PCR不僅擁有簡單、快速、重現(xiàn)性好、敏感度高、辨識性高等優(yōu)點，并且可以在單次的PCR反應中同時檢測多個物種的DNA。這種分析方法也適用于識別在不同的加工條件下的肉類和肉類產(chǎn)品的物種。
5.4 種特異性PCR
使用種特異性PCR（ species-specific PCR）鑒定肉和肉制品的物種比其他的PCR檢測方法更加的簡便、靈敏和快速。然而，單次PCR反應可檢測的物種數(shù)量卻被降低。這種PCR方法可以通過檢測目標DNA或線粒體DNA來鑒定肉的種類。豬的特異性DNA引物已被成功用來鑒定各種肉和肉產(chǎn)品，如生肉、熟肉、香腸、腌肉產(chǎn)品和漢堡包等[32]。種特異性PCR方法由于其操作簡單、高特異性和高靈敏度，是一個強大的牛肉鑒定手段，在加工和未加工的食物中皆適用。
線粒體DNA的12S rRNA，16S rRNA，d循環(huán)（D-loop）和細胞色素b區(qū)域（cytochrome b regions）
一般被用作目標物種鑒別的目標區(qū)域。通過使用設(shè)計在細胞色素b基因上的引物，種特異性PCR已成功應用于檢測和區(qū)分食品中的雞、火雞、豬、牛和羊的成分。
5.5 PCR-RFLP
PCR-RFLP技術(shù)（the restriction fragment lengthpolymorphis），即限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應技術(shù)，其基原理是用PCR擴增目的DNA，擴增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。此項技術(shù)大大提高了目的DNA的含量和相對特異性，而且方法簡便，分型時間短。但這種技術(shù)較為復雜的，并需要相配的實驗室，嚴格的分析技術(shù)和昂貴的酶。然而，這種分析方法針對熟肉的鑒定有著較大的潛能。有試驗證明，PCR-RFLP可在肉類混合物中，鑒定出不到1%的水平的雞和火雞肉。同樣，羊肉和山羊肉也可通過使用ApaI限制酶的PCR-RFLP分析來區(qū)分。
針對線粒體DNA使用PCR-RFLP技術(shù)，可以鑒別經(jīng)過鹵水、熱處理和發(fā)酵的近緣的肉制品，包括豬、牛、野豬、野牛、綿羊、山羊、馬、雞、火雞和野味等。然而，絕大多數(shù)的RFLP方法是適合用來定性檢測單一物種的肉，而混合物會產(chǎn)生復雜的指紋，并不容易解讀。
5.6 復合PCR
復合PCR技術(shù)（multiplex PCR）采用多對引物對目標基因與線粒體DNA進行測定，可以同步、準確和快速的在單次PCR反應中識別多個肉類品種。已有文獻表明，復合PCR可以用來識別雞肉、火雞肉、牛肉、豬肉、羊肉、驢肉和馬肉，其對熟肉和加工肉類的檢出限為1%。Dalmasso使用設(shè)定在線粒體12s rRNA基因的正向引物和特異性反向引物鑒定鵝、土番鴨、雞、的火雞和豬。
另有試驗使用設(shè)定在5S rRNA基因正向引物和 特異性反向引物鑒定出混合在鵝肝中的鴨肝。
5.7 Real-Time PCR
常規(guī)的PCR技術(shù)雖然可以對不同物種的混合肉類進行定性檢測，但卻不能實現(xiàn)對產(chǎn)品中的物種進行定量。而Real-Time PCR（又稱實時定量熒光PCR）不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時定量PCR是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進行分離。
有研究證實，通過對放大的線粒體12S rRNA基因、細胞色素b基因及16S rRNA基因進行Real-TimePCR試驗可以鑒別混合肉中肉的成分。而設(shè)計后的探針可以定量的分析馬肉、驢肉和豬肉的混合物，并且不局限于食物是否經(jīng)過加工和現(xiàn)今實驗人員可以通過對DNA進行測序來鑒定已知序列的肉類物種。經(jīng)過實驗人員的不斷測序分析，現(xiàn)今已有大量的常見動物物種、品種和基因變異的基因序列存于數(shù)據(jù)庫中，如美國國家生物技術(shù)信息中心的數(shù)據(jù)庫等。
只要物種擁有獨特的DNA序列，DNA測序都可以對其進行鑒定，就算是沒有任何參考資料的未知樣品也同樣可以進行鑒定。試驗方法為先通過PCR擴增來得到樣品的DNA序列，然后將其與數(shù)據(jù)庫中的大量已知物種信息進行比對，就可以得到樣品的物種。通過PCR擴增來識別 DNA序列是一種非常直接和有效的方式，通常會伴隨著凝膠電泳，并使用 Real-Time PCR對其結(jié)果進行定量分析。傳統(tǒng)的Sanger測序技術(shù)是通過雙脫氧鏈終止法對PCR反應完成時產(chǎn)物的長度進行的末端分析，得出模板鏈的堿基序列。然而由于Sanger測序法操作繁瑣、成本較高，不能滿足大規(guī)模測序的需要。新一代的測序方法則以高通量、低成本為主要特點，主要包括Illumina公司的Solexa測序技術(shù)、羅氏公司的454測序技術(shù)和ABI公司的SOLiD測序技術(shù)等，目前已廣泛應用于生命科學研究的各個領(lǐng)域。
5.8 DNA條形碼（DNA barcode）
2003年，加拿大Guelph大學的生物學家Paul Hebert教授首次提出利用線粒體細胞色素C氧化酶1（cytochromeC oxidase 1）基因構(gòu)建物種鑒別體系，而這段擁有648個堿基對的基因序列則被稱為DNA條形碼（通常被簡稱作CO1或COI），并期待像在零售業(yè)的發(fā)展過程中起到了舉足輕重作用的條形碼技術(shù)一樣，根據(jù)對1個統(tǒng)一的目標基因DNA序列的分析來完成物種鑒定的過程。
截止2011年已有112547種動物和近43 000植物、真菌和其他類型生物的DNA條形碼已存入數(shù)據(jù)庫中，并且這個數(shù)字還在不斷增加。DNA條形碼作為對地球上現(xiàn)有物種進行識別和鑒定的一項新技術(shù)， 受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。
在美國，為規(guī)范魚類交易，避免以次充好，美國食品和藥物管理局2011年年底宣布它將擴大其使用DNA檢測在檢查海鮮制造商和餐館。
6 結(jié)論
現(xiàn)階段可用于確定 肉類品種的方法大致可以分為5種： 物理技術(shù)、化學技術(shù)、免疫學技術(shù)、電泳技術(shù)、以及DNA鑒定技術(shù)。這些檢測方法是基于肉類品種之間的解剖差異、化學分析、蛋白質(zhì)或DNA鑒定而建立的。
物理和化學技術(shù)適合用于鑒定較為完整的生肉，并可以通過物理方法按照相應的標準對肉類的品質(zhì)進行分級，并由于其操作簡便，較為適用于現(xiàn)場執(zhí)法工作。而碎肉、肉末以及僅經(jīng)過適度加工的肉則適合采用免疫學和電泳方法，如SDS-PAGE、IEF和ELISA。
但是對于經(jīng)過熱加工的肉類而言，由于熱加工會使肉類的蛋白質(zhì)變性，因此基于DNA的檢測方法擁有著更高的可靠性，如傳統(tǒng)的DNA分析和實時PCR等。線粒體和基因組中的DNA均可以通過單拷貝和重復序列的方法PCR擴增序列，具體方法的選擇會極大程度的受到檢測極限的影響。如果需要定量的鑒定肉的種類，則需要選用基于實時PCR分析方法。最新的DNA條形碼技術(shù)正受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注，目前已越來越多的在肉類物種的鑒定和執(zhí)法工作中采用。
