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肉類(lèi)調(diào)理食品中細(xì)菌多樣性的分析

范曉攀1,2,王娉1,陳穎1,趙曉美1,談笑1,曹飛揚(yáng)1,黃文勝1,葛毅強(qiáng)2,3 (1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院;3.中國(guó)農(nóng)村技術(shù)開(kāi)發(fā)中心)

      來(lái)源:《肉業(yè)產(chǎn)業(yè)資訊》    2017年第6期
 
內(nèi)容摘要:摘要:肉類(lèi)調(diào)理食品方便快捷,營(yíng)養(yǎng)美味,深受消費(fèi)者青睞,但其豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)容易造成微生物的滋生,影響食品品質(zhì)和消費(fèi)者健
  摘要:肉類(lèi)調(diào)理食品方便快捷,營(yíng)養(yǎng)美味,深受消費(fèi)者青睞,但其豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)容易造成微生物的滋生,影響食品品質(zhì)和消費(fèi)者健康。高通量測(cè)序技術(shù)可以全面、準(zhǔn)確的研究肉類(lèi)調(diào)理食品中微生物群落結(jié)構(gòu),為微生物防控和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。本文通過(guò)均質(zhì)提取法對(duì)肉類(lèi)調(diào)理食品中微生物基因組進(jìn)行提取,并以16S rRNA可變區(qū)V3-V4作為測(cè)序片段,分析細(xì)菌多樣性。實(shí)驗(yàn)表明,4種肉類(lèi)調(diào)理食品細(xì)菌多樣性均較高,菌群結(jié)構(gòu)具有一定的相似性,炸雞塊、骨肉相連和冷凍牛排的優(yōu)勢(shì)菌群是Anderseniella屬,而羊肉串優(yōu)勢(shì)菌群是不動(dòng)桿菌屬,此外肉類(lèi)調(diào)理食品中還存在芽胞桿菌屬、梭菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬和乳球菌屬等。本論文明確了使用均質(zhì)提取法對(duì)肉類(lèi)調(diào)理食品中微生物進(jìn)行16S rRNA V3-V4區(qū)測(cè)序分析,為后續(xù)大規(guī)模菌群研究提供思路和方法。
  關(guān)鍵詞:肉類(lèi)調(diào)理食品;細(xì)菌多樣性;高通量測(cè)序;16S rRNA
  肉類(lèi)調(diào)理食品一般是指以畜和禽肉為主要原料,經(jīng)適當(dāng)加工,在冷凍或冷藏條件下貯存、流通和售賣(mài),可直接食用或簡(jiǎn)單加工后食用的肉類(lèi)制品,包括炸雞塊、烤翅、羊肉串、肉丸、煙熏火腿和冷凍牛排等。肉類(lèi)調(diào)理食品營(yíng)養(yǎng)豐富,且由于加工過(guò)程中殺菌不徹底,以及我國(guó)冷鏈設(shè)備不完善,容易滋生微生物。因此,開(kāi)展肉類(lèi)調(diào)理食品菌群結(jié)構(gòu)研究,分析微生物多樣性,有利于抑制致病菌和腐敗菌的產(chǎn)生,對(duì)肉類(lèi)調(diào)理食品的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。
  在菌群結(jié)構(gòu)的分析檢測(cè)方面,分子生物學(xué)技術(shù),如變性梯度凝膠電泳(DGGE)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)等,相對(duì)于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法,操作簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確度高,但是無(wú)法檢測(cè)樣本中低豐度的物種。近年來(lái),新興的高通量測(cè)序技術(shù)可以進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序,能夠客觀反映樣本中低豐度和不可培養(yǎng)的細(xì)菌,逐漸發(fā)展為菌群結(jié)構(gòu)研究的主流技術(shù),廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)境、食品等各個(gè)領(lǐng)域。Abdul-Mutalib等利用焦磷酸測(cè)序研究了不同衛(wèi)生等級(jí)餐廳案板上微生物菌群分布情況,發(fā)現(xiàn)案板上的菌群多樣性較高,且微生物數(shù)量與餐廳衛(wèi)生等級(jí)無(wú)關(guān),不同衛(wèi)生等級(jí)的餐廳均存在一定的安全隱患。
  二代測(cè)序以454和Illumina平臺(tái)應(yīng)用最為廣泛,菌群分析的測(cè)序基因主要是16S rRNA的9個(gè)可變區(qū),不同可變區(qū)對(duì)于不同菌屬細(xì)菌的分辨能力不同,根據(jù)研究需要和測(cè)序平臺(tái)選擇合適的測(cè)序片段,菌群分析相關(guān)文獻(xiàn)中涉及到的基因片段包括一個(gè)可變區(qū)(V3、V4和V6)、兩個(gè)可變區(qū)(V1-V2、V3-V4和V4-V5)或三個(gè)可變區(qū)(V1-V3、V3-V5和V4-V6)等,但目前還沒(méi)有統(tǒng)一的測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)。
  為了研究肉類(lèi)調(diào)理食品中細(xì)菌多樣性,本文采用均質(zhì)提取法對(duì)樣本中微生物基因組進(jìn)行提取,利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)完成微生物16S rRNA可變區(qū)V3-V4測(cè)序,分析肉類(lèi)調(diào)理食品菌群結(jié)構(gòu),對(duì)產(chǎn)品工藝改進(jìn)和微生物控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。此外,本文明確了使用均質(zhì)提取法和16S rRNA V3-V4區(qū)測(cè)序分析肉類(lèi)調(diào)理食品中微生物多樣性,為后續(xù)大規(guī)模菌群研究提供思路和方法。
  1  材料與方法
  1.1  實(shí)驗(yàn)材料
  炸雞塊、羊肉串、骨肉相連和冷凍牛排購(gòu)于北京市某大型超市,樣品均為普通袋裝,執(zhí)行速凍調(diào)理食品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10379-2012,購(gòu)買(mǎi)后按照產(chǎn)品貯存條件(-18℃以下)進(jìn)行冷凍保存,在保質(zhì)期內(nèi)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。樣本信息見(jiàn)表1。
表1 樣品主要信息
名稱(chēng) 規(guī)格 產(chǎn)地 生產(chǎn)日期
炸雞塊 500 g 山東 20150421
羊肉串 240 g 內(nèi)蒙古 20150128
骨肉相連 400 g 內(nèi)蒙古 20150422
牛排 300 g 河北 20150506
  1.2  儀器與設(shè)備
  拍打式均質(zhì)機(jī);恒溫水浴鍋;渦旋振蕩器;高速冷凍離心機(jī);小型臺(tái)式離心機(jī);PCR擴(kuò)增儀;電泳儀;凝膠成像儀。
  1.3  試驗(yàn)方法
  1.3.1  樣本前處理
  以無(wú)菌操作取樣品25g,充分剪碎后,加入到含有225mL生理鹽水的均質(zhì)袋中,使用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min,獲得樣品勻液。吸取上清30mL、2000r/min離心10min,沉淀食品雜質(zhì);吸取上清液20mL,10000r/min離心3min,緩慢倒掉上清液,獲得菌體沉淀。每個(gè)樣本均設(shè)置2個(gè)平行,炸雞塊、羊肉串、骨肉相連和冷凍牛排樣本編號(hào)分別為 J-JK、J-YR、J-GR和J-NP。
  1.3.2  基因組DNA提取
  使用QIAamp DNA Stool Mini Kit ,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取菌體沉淀基因組DNA。提取后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果。
  1.3.3  高通量測(cè)序
  提取的基因組DNA 送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序。首先使用細(xì)菌的通用引物341F(barcode-CCTACGGGNGGCW GCAG)和805R(barcode-GACTACHVGGGTATCTA ATCC)擴(kuò)增16S rRNA 基因V3-V4區(qū),第二輪擴(kuò)增引入 Illumina 橋式擴(kuò)增引物,并利用膠回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)Qubit 2.0精確定量后上機(jī)測(cè)序。
  1.3.4  數(shù)據(jù)分析
  通過(guò)Barcode區(qū)分樣本,并使用FLASH軟件將雙端測(cè)序序列拼接成單條序列。利用Prinseq過(guò)濾低質(zhì)量的序列,完成質(zhì)量控制。隨后使用Mothur軟件對(duì)序列進(jìn)行測(cè)序錯(cuò)誤校正,并采用chimeras.uchime去除序列中的嵌合體,獲得優(yōu)化序列?;谏鲜鰞?yōu)化序列,利用Uclust軟件聚類(lèi),以序列之間的相似性(0.97作為閾值,分成操作分類(lèi)單元(Operational Taxonomic Units,OUT),并采用RDP classifier完成物種分類(lèi)。最后使用R軟件進(jìn)行α多樣性指數(shù)的計(jì)算,繪制菌群豐度圖和樣本聚類(lèi)圖。
  2  結(jié)果與討論
  2.1  測(cè)序數(shù)據(jù)信息
  本研究使用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物16S rRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,測(cè)序平均序列讀長(zhǎng)459 bp,優(yōu)化后序列平均讀長(zhǎng)為420bp,通過(guò)對(duì)序列進(jìn)行歸類(lèi)操作,按照序列間的距離進(jìn)行聚類(lèi), 以0.97作為序列相似性 閾值劃分操作分類(lèi)單元 (OTU)。 本次實(shí)驗(yàn)將所有OTU比對(duì)到SILVA數(shù)據(jù)庫(kù),共得到28個(gè)門(mén)、57個(gè)綱、107個(gè)目和229個(gè)科共783個(gè)屬,其中包括62個(gè)無(wú)法鑒定的屬。各樣本的原始序列數(shù)、優(yōu)化序列數(shù)和 OTU 數(shù)及在門(mén)和屬水平對(duì)應(yīng)的細(xì)菌數(shù)見(jiàn)表 2。由表2可知,測(cè)序數(shù)據(jù)量基本滿(mǎn)足分析需求,4 種肉類(lèi)調(diào)理食品中微生物種類(lèi)很多,平均每個(gè)樣本中存在三百余種細(xì)菌。
表2 樣本16S rRNA V3-V4區(qū)測(cè)序數(shù)據(jù)信息
樣品 原始序列數(shù) 優(yōu)化序列數(shù) OTU數(shù) 門(mén)個(gè)數(shù) 屬個(gè)數(shù)
J-JK1 14394 14033 2325 17 296
J-JK2 15877 15481 2671 23 324
J-YR1 15243 14407 2953 17 285
J-YR2 19105 18224 3550 20 322
J-GR1 17598 17182 3143 18 324
J-GR2 21807 21289 3270 20 337
J-NP1 15331 14456 2897 23 347
J-NP2 11086 10564 2402 21 339
  Nam等對(duì)發(fā)酵食品中微生物V1-V2區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析,樣本序列數(shù)在18000~25000之間,OTU數(shù)在700~1100之間,本研究獲得的序列數(shù)和OTU數(shù)分別在11000~22000和2300~3500之間,樣本中細(xì)菌菌屬在285~347之間,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)采用的V3~V4區(qū)可以較好地鑒定各類(lèi)細(xì)菌,基本滿(mǎn)足物種在屬水平上的比較分析。而利用PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)骨肉相連,僅發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬等7個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬,與本實(shí)驗(yàn)檢出的300余種菌相比,PCR-DGGE技術(shù)無(wú)法客觀反應(yīng)低豐度物種,容易對(duì)微生物物種組成和豐度做出片面的判斷。
  2.2  α多樣性指數(shù)
  α多樣性指某個(gè)生境內(nèi)的多樣性,是評(píng)價(jià)生境內(nèi)部物種多樣性的指標(biāo)。α多樣性主要關(guān)注兩方面信息,一是群落所含物種種類(lèi)的多少,即物種豐富度,用Chao1 Index和ACE Index計(jì)算;二是群落中各物種的相對(duì)數(shù)量,即物種均勻度,既考察物種多樣性,又考察種的多度, 由Shannon Index和Simpson Index反映。表3顯示的是各樣本α多樣性指數(shù),由表3可知,各樣本菌群豐度很高,菌群多樣性也較高。測(cè)序深度指數(shù)(Coverage)是指各樣品文庫(kù)的覆蓋率,數(shù)值越高,越能反應(yīng)樣本的真實(shí)情況,本次實(shí)驗(yàn)覆蓋率在0.87~0.91之間,基本可以涵蓋樣本中大多數(shù)菌群,測(cè)序數(shù)據(jù)量滿(mǎn)足分析的需要。
表3 各樣本菌群多樣性指數(shù)
樣品 Chao1 Index ACE Index Shannon Index Simpson Index Coverage
J-JK1 4122.26 5268.99 5.52 0.06 0.91
J-JK2 5127.11 7021.04 5.38 0.05 0.90
J-YR1 7202.15 11397.51 6.17 0.01 0.87
J-YR2 7568.19 12374.41 6.21 0.01 0.88
J-GR1 6643.25 10471.15 6.00 0.02 0.89
J-GR2 6843.29 10479.30 5.82 0.02 0.91
J-NP1 5504.03 7421.04 5.83 0.04 0.89
J-NP2 4672.62 6693.76 6.00 0.02 0.87
  2.3  肉類(lèi)調(diào)理食品細(xì)菌多樣性
  實(shí)驗(yàn)樣本購(gòu)買(mǎi)于同一超市,均貯藏于-18℃以下冷凍條件下,但是不同樣本的肉類(lèi)品種來(lái)源、加工工藝與生產(chǎn)環(huán)境存在差異,因此,各樣本之間的主要細(xì)菌類(lèi)群、菌群比例也會(huì)存在一定的差異。
  在門(mén)分類(lèi)水平上,4 種肉類(lèi)調(diào)理食品中微生物主要是變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén),這兩類(lèi)細(xì)菌占總菌數(shù)的80%~90%左右,此外還存在少量的擬桿菌門(mén)和放線菌門(mén)等。在屬水平上,4種肉類(lèi)調(diào)理食品表現(xiàn)出一定的差異,圖1顯示了各樣本屬水平物種豐度較高的前20個(gè)序列信息。其中,炸雞塊中優(yōu)勢(shì)菌群是Anderseniella屬(占總序列數(shù)的45.21%),此外占總序列數(shù)2%以上的還包括乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)以及未分類(lèi)的菌屬等;羊肉串優(yōu)勢(shì)菌群是不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter,占總序列數(shù)的26.90%),還存在Anderseniella屬、梭菌屬(Clostridium)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、漫游球菌屬(Vagococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)以及泛菌屬 (Pantoea) 等;骨肉相連優(yōu)勢(shì)菌群是Anderseniella 屬(占總序列數(shù)的25.32%),此外還存在泛菌屬(Pantoea)、梭菌屬(Clostridium)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、香味菌屬(Myroides)以及腸桿菌屬(Enterobacter)等;冷凍牛排優(yōu)勢(shì)菌群是Anderseniella 屬(占總序列數(shù)的28.49%),此外還存在漫游球菌屬(Vagococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、泛菌屬(Pantoea)、鏈球菌屬(Streptococcus)、魏斯氏菌屬(Weissel la)以及梭菌屬(Clostridium)等。
  本實(shí)驗(yàn)在肉類(lèi)調(diào)理食品中檢出Anderseniella的存在,且占據(jù)較大比例。Anderseniella是革蘭氏陰性菌,異養(yǎng)需氧型,屬于變形菌門(mén)、α變形菌綱、根瘤菌目、紅菌科,與紅菌屬(Rhodobium)相似度很高,Anderseniella目前僅包含Anderseniella baltica一個(gè)種,曾從波羅的海缺氧表沉積物中分離出來(lái),可以在鹽度0.8%~6%之間生長(zhǎng)。有關(guān)Anderseniella的研究文獻(xiàn)較少,目前還沒(méi)有文獻(xiàn)顯示Anderseniella在肉類(lèi)食品中檢測(cè)或者分離出來(lái)。而本實(shí)驗(yàn)使用二代測(cè)序技術(shù)檢出Anderseniella在肉類(lèi)調(diào)理食品中存在,這可能與食品的生產(chǎn)工藝有關(guān)。炸雞塊、羊肉串、骨肉相連和冷凍牛排生產(chǎn)工藝流程有一定的相似性,將肉類(lèi)原料預(yù)處理(清洗并切塊等)后,再加入食鹽等調(diào)味料腌制一定的時(shí)間,熟制或不經(jīng)過(guò)熟制后,真空包裝、冷凍保藏。由于調(diào)理食品需要進(jìn)行腌制,腌制過(guò)程中高鹽度對(duì)微生物進(jìn)行了選擇和富集,4種肉類(lèi)調(diào)理食品營(yíng)養(yǎng)成分表顯示,鈉含量在4.81mg/g~14mg/g之間,若鈉均以氯化鈉形式存在,那么換算成鹽度,4種食品鹽度介于1.22%~3.56%之間,適于Anderseniella的生長(zhǎng),而對(duì)其他菌屬具有抑制作用,因此腌制過(guò)程結(jié)束后Anderseniella可能大量存在于食品中。
 
 
圖1 各樣本在屬水平物種豐度圖
  注:a,炸雞塊,b,羊肉串;c,骨肉相連;d,牛排。
  雖然肉類(lèi)調(diào)理食品種類(lèi)不同,但菌群結(jié)構(gòu)存在一定的相似性。在物種豐度較高的前20 個(gè)序列中,Anderseniella屬、不動(dòng)桿菌屬、芽胞桿菌屬、梭菌屬、泛菌屬和假單胞菌屬是4種肉類(lèi)調(diào)理食品中的共有菌群,乳球菌屬、嗜冷桿菌屬、乳桿菌屬、香味菌屬、漫游球菌屬、沙雷氏菌屬和泛菌屬等也廣泛存在于肉類(lèi)調(diào)理食品中。除了Anderseniella,其他菌屬在肉及肉制品中常有檢出。其中革蘭氏陽(yáng)性菌有乳球菌屬、乳桿菌屬、芽胞桿菌屬、梭菌屬和漫游球菌屬;革蘭氏陰性菌有Anderseniella、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、嗜冷桿菌屬、泛菌屬、香味菌屬和沙雷氏菌屬。乳球菌屬和乳桿菌屬是乳品發(fā)酵中有益微生物,常用于干酪和酸牛乳的生產(chǎn);芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬和不動(dòng)桿菌屬?gòu)V泛存在于自然界,部分菌種是食品腐敗菌或人致病菌,如蠟樣芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌、銅綠假單胞菌、粘質(zhì)雷氏菌和鮑曼不動(dòng)桿菌等。
  肉類(lèi)調(diào)理食品中細(xì)菌種類(lèi)較多,除了來(lái)源于動(dòng)物腸道,還可能來(lái)源于動(dòng)物屠宰、食品加工和包裝等每一個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié),肉及肉制品所接觸的外界環(huán)境、加工用具、包裝材料和人員等均會(huì)造成微生物污染,肉制品之間也存在交叉污染。因此,各食品企業(yè)需要加強(qiáng) 對(duì)原料肉的檢測(cè),實(shí)施規(guī)范化生產(chǎn)、標(biāo)準(zhǔn)化管理,重點(diǎn)對(duì)動(dòng)物屠宰、切割及修整過(guò)程微生物污染進(jìn)行監(jiān)管和控制,保證產(chǎn)品質(zhì)量。此外,很多肉類(lèi)調(diào)理食品在流通和貯藏過(guò)程中需要冷藏或冷凍保存,而我國(guó)冷鏈系統(tǒng)尚不完備,溫度的波動(dòng)也為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供條件。
  值得關(guān)注的是,肉類(lèi)調(diào)理食品中的優(yōu)勢(shì)菌群并不是嗜冷菌,這與我們實(shí)驗(yàn)前的理論推測(cè)是不同的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,盡管樣本的貯存條件是-18℃,但仍然存在生長(zhǎng)溫度在30℃~37℃的中溫菌,如不動(dòng)桿菌屬、梭菌屬、泛菌屬和明串珠菌屬等。這些菌屬很可能處于“活的不可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable but nonculturable state,VBNC)”,即喪失細(xì)菌可培養(yǎng)的特征,但是細(xì)胞膜完整,有一定的代謝活力,遇到適宜條件,可恢復(fù)到可培養(yǎng)的狀態(tài),這是某些無(wú)法產(chǎn)生芽胞的細(xì)菌對(duì)抗環(huán)境壓力的一種反應(yīng)。研究表明,溫度是誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)最主要的原因,因此肉類(lèi)調(diào)理食品在冷凍處理時(shí),埃希氏菌屬、志賀氏菌、腸球菌和弧菌等很可能進(jìn)入VBNC狀態(tài),一旦遇到適宜的生長(zhǎng)條件,便會(huì)再次復(fù)蘇,對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成危害。
  2.4  樣本間菌群結(jié)構(gòu)比較
  維恩圖可在OTU水平對(duì)4種肉類(lèi)調(diào)理食品中菌群進(jìn)行分析,圖2直觀的反映了樣本間的共有OTU和特有OTU。為了清楚顯示,本實(shí)驗(yàn)將2個(gè)平行樣本合并分析(J-JK1和J-JK2合并為J-JK,其他樣本類(lèi)同),J-JK、J-YR、J-GR和J-NP獲得的OTU數(shù)分別為3486、5014、5122和3773,所有樣本共含有12000余種不同的OTU。由圖可知,每2種實(shí)驗(yàn)樣本之間相同的OTU數(shù)在1019~1902之間,4種樣本之間相同的OTU數(shù)為502個(gè),占總OTU數(shù)的4.16%。


圖2 操作分類(lèi)單元維恩圖
  為了從微生物種類(lèi)和豐度層面研究4種肉類(lèi)調(diào)理食品的異同,本研究基于Bray-Curtis指數(shù)繪制樣本聚類(lèi)圖,如圖3所示,菌群組成相似度越高的樣本在圖中的距離越小。整體而言,4 種肉類(lèi)調(diào)理食品之間具有很大的相似性,其中,炸雞塊和牛排、羊肉串和骨肉相連相似度較高,分別聚為一簇。而同為雞肉制品的炸雞塊和骨肉相連并未表現(xiàn)出明顯的相似性,這可能是二者加工工藝、加工環(huán)境不同引起的。此外,在樣品中檢測(cè)出了不可分類(lèi)微生物,如unclassified Rhodobacteraceae和unclassified Anaerolineaceae等,這是由于測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列不匹配或相似度不夠閾值,因此這些序列被歸為不可分類(lèi)的微生物。


圖3 各樣本在屬水平聚類(lèi)圖
  3  結(jié)論
  利用高通量測(cè)序技術(shù)可以直接從食品中提取微生物基因組,對(duì)不可培養(yǎng)細(xì)菌和低豐度細(xì)菌也可有效檢測(cè),能夠客觀分析食品中菌群結(jié)構(gòu),且高通量測(cè)序技術(shù)可以對(duì)多個(gè)樣本同時(shí)檢測(cè),相對(duì)于傳統(tǒng)方法能夠迅速、高效的完成樣本菌群分析。本論文明確了使用均質(zhì)提取法提取微生物基因組,并采用二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行16S rRNA V3-V4區(qū)測(cè)序,為后續(xù)大規(guī)模菌群研究提供思路和方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肉類(lèi)調(diào)理食品中細(xì)菌多樣性高,4種肉類(lèi)調(diào)理食品菌群結(jié)構(gòu)具有一定的相似性,在門(mén)分類(lèi)水平,主要是變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)組成;在屬水平,Anderseniella 屬、不動(dòng)桿菌屬、芽胞桿菌屬、嗜冷桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、泛菌屬和假單胞菌屬等廣泛存在,這些微生物可能來(lái)源于動(dòng)物腸道、動(dòng)物屠宰、食品加工和包裝等加工工序,因此,各食品企業(yè)需要優(yōu)化生產(chǎn)工藝,加強(qiáng)生產(chǎn)管理,制定標(biāo)準(zhǔn)化操作流程,保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。
 
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